Research

□ 誘電泳動による細胞分離の高効率化

はじめに

　近年、多様な細胞を含む細胞サンプルから特定の細胞を分離する技術の一つとして，不均一交流電場による誘電泳動(Dielectrophoresis; DEP)の 原理を用いた手法に高い関心が寄せられています．細胞分離技術の中でも特に開発が急務とされるのが，多量の細胞試料の中にわずかに含まれる稀少細胞を， 損傷させることなく短時間で正確に分離する技術です．この技術は例えば，転移性がん患者の末梢血中に現れる血中循環癌細胞の検出，白血病などの難治性 疾患の治療に用いられる造血幹細胞の骨髄細胞からの分離，iPS細胞における強い癌性を持つ未分化細胞の分化細胞群からの分離など，がんの超早期診断， 細胞移植や再生医療といった最先端医療分野で強く開発・実用化が望まれています．

　しかしながら，いずれの希少細胞においても存在頻度は0.01%未満という極めて低い値であるため，分離・抽出が極めて困難です．このような希少細胞 を分離するには，現在の誘電泳動法の技術では動作原理の制約上，試料の前処理に多大な時間と手間，費用を要します．

高効率細胞分離デバイスの提案

　当研究室では、多量の細胞試料の分離を可能にする方法として，流路全域に3次元の不均一電場を生成させる手法を提案し，その有効性について 数値シミュレーションを行うことで検証を行いました．

　図１は提案デバイス内での電場分布を示したものです．従来タイプの平行平板型デバイスでは，底板だけに電極を設置しているため，底面から限られた高さの 領域でのみ不均一交流電場が生成されましたが，電極を図のような配置にすることにより，流路全域に不均一交流電場を生成することが出来，細胞分離効率を 高めることが可能になりました．

実験装置と実験方法

　図２は実験装置と製作した細胞分離デバイスの概略図です．対向式櫛形電極はガラス板に厚さ300nmのアルミ薄膜を真空蒸着することで製作しました． 実験はヒト乳腺上皮細胞（MCF10A)）の生／死細胞（図３）もしくは正常細胞（MCF10A)と癌細胞（MCF7，MDA-MB-231）をマンニトール等張溶液に１：１に 混合させた細胞試料をシリンジポンプで一定の流量でデバイスに流し，電場を印加させて細胞分離を行います．

生／死細胞の分離実験

　図３はヒト乳腺上皮細胞の生／死細胞をデバイス内に流した時の，細胞が分離される様子を捉えた蛍光画像です．緑色は生細胞，赤色は死細胞を表しています． 生細胞（緑）は接地電極の上部（図１の電場分布の青色の領域）に集められ，接地電極に沿って下流に流されてゆきます．死細胞は高電圧電極（図１の電場分布の 赤～黄色の領域）の端部に捕獲され，電極に沿ってクラスタを形成します．この図から，生／死細胞の分離が効率よく行われる様子が分かり，分離効率も98%に達したことから 提案デバイスの有効性が実証されました．

正常／癌細胞の分離実験

　図４はヒト乳腺上皮細胞の正常／癌細胞をデバイス内に流した時の細胞分離の様子を捉えた明視野画像です．電場を印加することで正常細胞は電極に吸着し， 癌細胞はそのままデバイス下流に流されて行きます．電極に吸着した正常細胞は電極間にまたがるブリッジを形成しているのもわかります．この図から，正常／癌細胞の 分離が行われる様子が分かりますが，分離効率は80%程度に留まりました．その理由としては，図に示すように電極上のほとんどの吸着サイトが正常細胞によって 占有されているためと考えられ，今後解決が必要な課題点です．

　　　　　　　図１　　　　　　　　　　　　　　図２　　　　　　　　　　　　　　図３　　　　　　　　　　　　　　図４

担　　当：

多田教授，富山(B4)

論　　文：

Shigeru Tada, Masako Hayashi, Masanori Eguchi, Akira Tsukamoto: High-throughput Separation of Cells by Dielectrophoresis Enhanced with 3D Gradient AC Electric Field, Biomicrofluidics, Vol.11, No.6, pp.064110-1-064110-14, 2017. (2017 Editor's Picks)

Shigeru Tada, Yan Shen, Zhiyong Qiu: Modeling and Simulation of Dielectrophoretic Collective Dynamics in a Suspension of Polarizable Particles Under the Action of a Gradient AC Electric Field, Electrophoresis, Vol.38, No.9, pp.1434-1440, 2017.

Shigeru Tada, Zhiyong Qiu, Yan Shen: Concentration-tuned Interactions and Structures in Flowing Suspensions Under a Gradient AC Electric Field, Journal of Applied Physics, Vol.120, No.17, pp.174505-1-174505-11, 2016.

Shiegru Tada, Arisa Nakanishi, Masanori Eguchi, Keigo Ochi, Megumi Baba, Akira Tsukamoto: Enhancement of Continuous-flow Separation of Viable/nonviable Yeast Cells Using a Nonuniform Alternating Current Electric Field with Complex Spatial Distribution, Biomicrofluidics, Vol.10, No.4, pp.034110-1-034110-14, 2016.

Shigeru Tada, Tomoyuki Natsuya, Akira Tsukamoto: Numerical Simulation of Dielectrophoretic Separation of Live/Dead Cells Using a Three-dimensional Nonuniform AC Electric Field in Micro-Fabricated Devices, Biorheology, Vol.52, No.3, pp.211-224, 2015.

Shigeru Tada, Yan Shen, David Jacqmin, Bingmei Fu, Zhiyong Qiu: Understanding Electric Interactions in Suspensions in Gradient AC Electric Fields II - Simulations and Application, International Journal of Modern Physics B, Vol.25, No.7, pp.927-933, 2011.

Yan Shen, Zhiyong Qiu, Shigeru Tada: Understanding Electric Interactions in Suspensions in Gradient AC Electric Fields I - Experimental, International Journal of Modern Physics B, Vol.25, No.7, pp.919-925, 2011.

学会発表：

◯多田 茂, 林 雅子, 逢見優衣, 塚本 哲: 三次元不均一電場での誘電泳動による細胞分離, 日本機械学会第29回バイオエンジニアリング講演会, 2017年1月19日（木）～20日（金）, ウインクあいち

◯多田茂, 中西有咲, 大地健吾, 塚本哲: 誘電泳動による細胞分離の高効率化, 日本機械学会第28回バイオエンジニアリング講演会, 2016年1月9日（土）～10日（日）, 東京工業大学　大岡山キャンパス

◯多田茂:三次元不均一交流電界を用いた細胞分離, 日本機械学会第27回バイオエンジニアリング講演会, 2015年1月9日（金）～10日（土）, 朱鷺メッセ　新潟コンベンションセンター

◯Shigeru Tada: Separation of Live/Dead Cells by the Use of Three Dimensional Non-uniform AC Electric Field, World Automation Congress 2014, 3-7 August 2014, Hawaii, USA

◯多田茂: 3D 不平等電界を用いた誘電泳動による細胞分離, 日本機械学会第26回バイオエンジニアリング講演会, 2014年1月11日（土）～12日（日）, 東北大学　片平キャンパス

◯多田茂: 誘電泳動力を用いた細胞操作の数値解析, 日本機械学会2013年度年次大会, 2013年9月8日（日）～11日（水）, 岡山大学　津島キャンパス